数据提供 : 大阪大学大学院 齿学研究科 口腔科学先端口腔生物学教室  荒木 保弘 老师

<实验目的>
确认通过Marker基因已将染色体上目的基因破坏。

<实验方法>
【样品的种类】
从酵母提纯的基因组DNA

【样品的制备方法】
用黄色枪头的取火柴头大小的克隆，加入PCR管内用0.02M NaOH 50 μl进行悬浊。
PCR时将酵母悬浊液在95度热处理10分钟。

【目的基因名称与长度】
PIB2 / 2,345 bp     pib2::natNT2 / 1,783 bp
GTR1 / 1,128 bp    gtr1::kanMX4 / 1,679 bp

【引物序列】
Forward Primer  : CGGATGCTATGTCACGTTG (PIB2)               
Reverse Primer  : TCTTTACTGCTGTTGTGTCC (PIB2)
Forward Primer  : ACCCTAAATTGTGATTATGG (GTR1)                                          
Reverse Primer  : TTCTTCCTCTTATGTTTCTC (GTR1)    

【反应液组分】                                 【PCR循环】
                            (μl)   
 灭菌蒸馏水                       3.9                98℃  10sec.  
 KOD OneTM PCR Master Mix -Blue-  5               53℃    5sec. 35cycles
 10μM Forward Primer           0.3                  68℃  10sec.  
 10μM Reverse Primer           0.3    
 Template                       0.5    
 -------------  
 Total 10

取一半PCR反应液 (5μl)进行电泳。

【仪器类型】
Applied Biosystems GeneAmp® PCR System 9700

 <结果·讨论>
  ・PCR时间可以大幅度缩短。
  ・目的基因的扩增效率也得到了改善。
  ・因为是All in one，所以PCR反应液容易制备。
 

<感受·建议等>
平时经常做大量的PCR，是一种较重的负担。但是，自从使用了KOD One之后，这种负担减轻了很多。以前我们针对不同实验目的使用贵公司几种不同的KOD产品。从反应速度和保真性来说， 现在只要使用KOD One就可以了，所以从经济方面来说是非常有利的。