数据提供 : 福岛县里医科大学 医学部 放射性同位元素研究设施  关亦 正幸 老师

<实验目的>
为构建动物细胞表达载体，扩增 mouse c-Maf cDNA全长序列

<实验方法>
【样品的种类】
从老鼠T细胞中抽提的total RNA

【样品的制备方法】
使用ISOGEN(Nippon gene)制备total RNA，之后使用PrimeScript RT Master mix(Perfect Real Time)(Takarabio)合成cDNA，然后以该cDNA为模板。

【目的基因名称与长度】
mouse c-Maf cDNA / 1.2 kb 

【引物序列】
Forward Primer:GGGATCCGATGGCTTCAGAACTGGCAA
长度: 27 mer                   Tm: 65.1 ℃
Reverse Primer:GGTCGACCATGAAAAATTCGGGAGAGG
长度 :27 mer                   Tm: 63.5 ℃

■KOD OneTM PCR Master Mix -Blue-
【反应液组分】                                      【PCR循环】
  (μl)  
 KOD OneTM PCR Master Mix -Blue-   3           94℃   2min.  
 10μM Forward Primer            1                98℃  10sec.  
 10μM Reverse Primer            1                55℃    5sec. 30cycles
 Template                        1                   68℃  15sec.  
 ------------------  
 Total   6  

■X社 PCR Master Mix
【反应液组分】                                 【PCR循环】
  (μl)  
 PCR Master Mix           3                   94℃   2min.  
 10μM Forward Primer   1                    98℃  10sec.  
 10μM Reverse Primer   1                   55℃    5sec. 30cycles
 Template               1                     68℃  15sec.  
   
 Total   6  

 【仪器类型】
Bioer Technology  LifeECO ver 2.0

< 结果·讨论>
 
KOD One可扩增GC含量多的1.2kb 的c-Maf cDNA。X公司的PCR Master Mix虽然也可以扩增，但扩增产物中出现了GC含量高的区域的缺失。

<感受·建议等>
扩增序列中存在GC含量高达70%的区域超过94%的连续GC片段。因此，通常的Taq聚合酶不能扩增、或即使能扩增，也会产生高度连续的GC缺失使用扩增片段变短。虽然通过添加DMSO可以改善PCR反应，但是能否得到稳定的结果尚不明确。比较的X公司的Taq系PCR Master Mix，其中扩增能力高的高保真性酶，如图(Lane 2)所示，有些高连续GC序列就产生了缺失的短链。针对这种情况，使用KOD OneTM PCR Master Mix -Blue-(Lane 1),可检测出全长1.2kb的扩增的主条带。将主条带进行克隆与测序，确认碱基序列是正确的。由此可见，KOD OneTM PCR Master Mix -Blue-可用于高度连续的GC序列的高保真性扩增。