数据提供 : 东北医科药科大学 药学科 感染生体防御学教室  田中 大 

<实验目的>
使用PCR法选择A. fumigatus flbC 基因重组体。

<实验方法>
【样品的种类】
Aspergillus fumigatus 胞子

【样品的制备方法】
极微量(用枪头前端稍微挑取)的 Aspergillus fumigatus 孢子用100μL TE buffer悬浊，微波炉处理(500W、2分钟)，取上清。

【目的片段基因名称与长度】
   flbC (Afu2g13770)      1,500  bp   
   ptrA           2,600  bp
  
【引物序列】
Forward Primer  : TCTCATCTGCTCCCTTCATCT
Reverse Primer  : ATTGTACAAGGGACGAGAGCC

■KOD One® PCR Master Mix
【反应液的组成】                                                         【PCR循环】
  (μL)  
  灭菌蒸馏水                              8.8                          98℃  10sec.   40cycles
  KOD One® PCR Master Mix       10                            68℃  20sec.
  10μM Forward / Reverse Primer 各0.1  
  微波处理的悬浊液                    1    
   ----------------------
  Total Volume 20  

■KOD FX Neo
 【反应液的组成】                                                         【PCR循环】
  (μL)  
  灭菌蒸馏水                              7.4                        98℃  10sec.   40cycles
  2×PCR Buffer                          10                          68℃ 240sec.
  20mM dNTPs                           1  
  10μM Forward / Reverse Primer 各0.1    
  KOD FX Neo                            0.4  
  微波炉处理 孢子悬浊液    1  
   ---------------------------
  Total Volume 20  
 
【循环仪机型】T100 Thermal cycler (Bio-Rad)


<结果·讨论> 
以Aspergillus fumigatus A1159株为亲代菌种，将含有flbC 基因的编码区上・下游相同的序列及含抗硫胺素耐性基因ptrA序列的 DNA片段 插入该菌株，获得插入突变体  (flbC 基因缺失菌株 #1～3)

将这些突变体及亲代的孢子用微波炉处理得到的溶液为模板，分别用KOD One和KOD FX Neo 进行菌落 PCR。之后，通过琼脂糖凝胶电泳比较基因突变是否成功及两酶的性能。
结果显示，两种酶都可以扩增基因突变体・亲代，得到 PCR产物。即，两种酶都可用于通过菌落PCR法检测基因突变是否成功。另一方面，PCR所需要的时间，KOD One大约55分钟、KOD FX Neo 是 200分钟。

该实验显示，KOD One对粗样品扩增能力强，且菌落PCR所需要的时间大大缩短。

<感受及建议等>
自从同事介绍说「使用KOD FX Neo进行霉菌孢子的菌落 PCR 结果很好」以来，对于基因重组的霉菌的基因分型，全部使用 KOD FX neo来扩增。但是， KOD One 不仅可以大大缩短延伸时间，而且还可以与KOD FX Neo 同样能够扩增粗样品，实在是让人惊喜。我想今后将继续使用KOD One。