用途
PCR、RT-PCR
说明
本酶是来源于高度嗜热菌Thermus thermophilus HB8的耐热性DNA 聚合酶，经大肠杆菌表达生成的重组型酶。
本酶具有逆转录活性，该活性在Mn2+存在的情况下会得到强化。利用该性能，可以用同一酶在同一试管中进行逆转录反应和PCR反应。
另外，本酶耐热性比Taq DNA 聚合酶高，对GC含量丰富的目的片段的扩增效率更出色。
特征
●高效率
与Taq DNA聚合酶相比，该酶对GC含量丰富的目的片段及粗样品的扩增效率更出色。
●可用1酶体系完成RT-PCR
由于本酶在Mn2+存在条件下显示RTase活性，只用本酶即可完成 RT-PCR。
且本酶在60℃时可进行RT反应，因此适用于GC含量丰富的目的片段、容易形成高级结构的目的片段的扩增。
实验例
1.使用Tth DNA Polymerase进行基因组PCR扩增
使用本酶，以50ng人的基因组为模板，进行PCR扩增长度180bp〜1.3kb的目的片段。
结果可见，各模板都得到了良好的扩增。
使用本酶可对各种目的片段进行PCR扩增。
2. 使用rTth DNA Polymerase进行RT-PCR的实验例
使用本酶，以酵母Total RNA 1μg为模板，对actin(目的片段长180bp和300bp)进行RT-PCR、以及分别以人的Total RNA(100pg、10pg)对易于形成二级结构的18S rRNA(380bp)进行RT-PCR。
另外，对18S rRNA使用M-MLV RTase + Taq DNA Polymerase进行RT-PCR并进行了比较。
RT反应条件
含有0.2mM dNTPs、1mM MnCl2、Reverse Primer 2pmoles/μl、10U RNase Inhibitor及 5U rTth DNA Polymerase的RT Buffer(10mM Tris-HCl(pH8.3)、90mM KCl)20μl反应液，60℃、30min.进行反应。
PCR条件
按1×浓度添加10×Chelating Buffer(100mM Tris-HCl(pH8.3)、1M KCl、7.5mM EGTA、0.5% Tween20)，然后添加Forward Primer，使终浓度0.4pmoles/μl、MgCl2，使用终浓度为1.88mM，以终体积100μl的反应体系进行循环。
结果显示，可以得到良好的RT-PCR结果。另外，可以确认：以易于形成二级结果的rRNA为模板进行RT-PCR，60℃条件下进行RT反应的rTth DNA Polymerase比在42℃条件下进行RT的M-MLV RTase能得到更强的扩增效果。
这次虽然是使用的rTth DNA Polymerase，但是使用Tth DNA Polymerase也没有问题。
另外，一步法反应中进行RT和PCR反应时，推荐使用本酶的试剂盒「RT-PCR Quick Master Mix」。
参考文献
1) T. W. Myers and D. H. Gelfand, Biochem., 30: 7661-7666(1991)
2) K. Yamada et al., J. Biochem.(Tokyo), 130: 335-340(2001)
- 产品内容
Tth DNA Polymerase(5U/μl) 50μl
10×Buffer[TTH-3R] 1ml
Dilution Buffer[TTH-3D] 1ml
2mM dNTPs[NTP-201]* 1ml
*用本酶进行PCR时，请使用dNTPs[NTP-201]。其他的dNTPs，有时不能充分发挥PCR性能。
组分:
10mM Tris-HCl(pH7.5)
300mM KCl
0.1mM EDTA
1mM DTT
1% Triton® X-100
500μg/ml BSA
50% Glycerol
10×Buffer组成:
100mM Tris-HCl(pH8.9)
800mM KCl
15mM MgCl2
1% Triton® X-100
1% 胆酸钠
5mg/ml BSA
Dilution Buffer组分:
与组分相同。
活性的定义:
在75℃活性测定条件下，在30分钟内摄入10nmoles的全核苷酸使成为酸不溶物时所需酶的活性定义为1U。
来源:
E.coli 重组体
- 注意事项
*酶溶液中虽然含有消防法危险物 第4类 易燃液体 第3石油类 属于水溶性液体的50%的甘油，但是已确认在着火点测试实验中不属于危险物。
- 几点建议
●PCR产物的克隆
使用本酶得到的PCR产物，与Taq DNA 聚合酶相同，可通过TA克隆进行克隆。因本酶具有校正活性，PCR时的保真性在Mg2+存在条件下与Taq DNA 聚合酶大致相同。
可使用高效率TA克隆试剂盒「TArget CloneTM」进行实验。
●PCR条件的设定
基本上与Taq DNA聚合酶反应条件相同。不能扩增时，从变性到退火的过程中，设定1sec./1℃的坡度，有时比较好。
●RT-PCR反应
本酶在Mn2+存在条件下，虽然使用单酶可完成逆转录反应与PCR，但是保真性会下降，所以不适用于RT-PCR产物的测序或克隆目的的实验。
相关产品
(另外销售的包装)
| 品名 | Code No. | 包装 | 价格 | 保存温度 | 说明书下载 |
|---|---|---|---|---|---|
| rTth DNA Polymerase用Buffer | TTH-3R | 1ml×1支 | RMB 50 | -20℃ | - |
| rTth DNA Polymerase用Dilution Buffer | TTH-3D | 1ml×1支 | RMB 50 | -20℃ | - |
| dNTPs Mixture(2mM) | NTP-201 | 各2umoles/1.0ml × 1支 | RMB 65 | -20℃ | - |
●高效率TA克隆试剂盒
| 品名 | Code No. | 包装 | 价格 | 保存温度 | 说明书下载 |
|---|---|---|---|---|---|
| TArget Clone™ | TAK-101 | 10次份 × 1支 | RMB 300 | -20℃ |
|
●使用Tth聚合酶的一步法RT-PCR试剂盒
| 品名 | Code No. | 包装 | 价格 | 保存温度 | 说明书下载 |
|---|---|---|---|---|---|
| RT-PCR Quick Master Mix | PCR-311F | 50次份 | RMB 1,800 | -20℃ |
|
