对M-MLV RTase进行了改良 提高了延伸性・反应效率・高温反应性。
高效率逆转录酶 ReverTra Ace®
用途
1链cDNA的合成
说明
RNaseH活性在cDNA合成中，会分解作为模板/引物的DNA-RNA杂交体中的RNA，导致反
应效率下降。而本酶可降低该RNaseH活性。ReverTra Ace®通过在M-MLV(Moloney Murine Leukemia Virus) RTase基因的RNaseH活性结构域导入点突变，降低了该活性。
另外，RNA的高级结构会阻碍RTase反应的进行，使得cDNA合成困难。本酶通过在DNA合成结构域导入点突变，提高了反应效率及高温反应性能，所以可在高温下进行反应。因此，可通过提高反应温度来缓和模板RNA的高级结构，可促进RTase对cDNA的合成反应。
另外，本酶比原有的deletion型M-MLV RTase RNaseH−相比，高出其约4倍的活性，可高效率地进行cDNA合成。
特征
●提高了延伸性
去除了M-MLV RTase的RNaseH活性，延伸性有了明显的提高。
●提高了反应效率・高温反应性
通过在M-MLV RTase的DNA合成区域中导入点突变及改良反应组分，提高了高温反应性和反应效率。
●最适合于RT-PCR
可在各种条件下进行逆转录反应，特别适用于RT-PCR。
原理
实验例
1. 42〜60℃时的cDNA合成反应
以带有poly(rA) Tail，长度分别为9.49、7.46、4.40、2.37、1.35kb的RNA 0.4μg为模板，以oligo(dT)20 25pmoles为引物，在42〜60℃的反应条件下，用本酶100U，进行30min.的cDNA合成反应。
结果显示，用ReverTra Ace，在42℃及50℃时生成了9.49kb、55℃生成了4.4kb、60℃生成了2.37kb的cDNA合成产物。
2. cDNA合成效率的比较
以在in vitro条件下合成的G3PDH的RNA 102〜105copies为模板，使用G3PDH的下游引物，42℃、20min.进行cDNA合成反应后，加入G3PDH上游引物，用rTaq DNA Polymerase(Code No.TAP-201)进行PCR反应。
结果可见，用ReverTra Ace，即便是以102copies的RNA为模板合成的cDNA为模板，也可确认到扩增产物。
3. 14kb的cDNA合成反应
以Human骨骼肌poly(A) RNA为模板，使用dystrophin mRNA的3'端的特异性cDNA合成用引物，42℃、30min.进行cDNA合成反应后，使用mRNA的5'端特异性PCR引物对（位于cDNA合成引物上游14kb处），用KOD Dash(Code No.LDP-101) 进行PCR，判断有无延伸。
结果可见，使用ReverTra Ace，可合成14kb以上的cDNA。
参考文献
1)K.Miyazaki et al.,J.Bacteriology.,185:2219−2226(2003)
2)A.Nezu et al.,Biochem.J.,263:59−66(2002)
3)S.Nakashima et al.,J.Biochem.(Tokyo),131:241−246(2002)
4)S.Atsumi et al.,EMBO J.,20:5453−5460(2001)
5)Y.Yabuta et al.,Plant Cell Physiol.,41:666−675(2000)
6)S.Lee et al.,Gene,245:253−266(2000)
商品使用文献
1)T. Ikeda et al., Endocrinology 142(4): 1419-1426.(2001)
2)S. Ohuchi et al., Nucleic AcidsResearch, 30(15): 3473-3480.(2002)
3)K. Minami et al., ToxicologicalSciences 87(1): 296-305.(2005)
- 产品内容
ReverTra Ace®(100U/μl) 100μl
5×Buffer* (TRT-1B) 1ml
*5×Buffer中不含有dNTPs。
组分:
50mM Tris-HCl (pH7.5)
100mM NaCl
0.1mM EDTA
10mM DTT
0.01% Nonidet® P-40
50% Glycerol
活性的定义:
以Poly(rA):Oligo(dT)20为模板/引物，在42℃下，10分钟内摄入1nmole的dTTP使成为酸不溶性沉淀物时所需的酶量为1U。
纯度:
50U的本酶和0.2μg的MS2 RNA在42℃下反应1小时，RNA电流模式未见变化。
来源:
E.coli 重组体
- 基本反应条件
灭菌蒸馏水 Xμl
模板RNA
total RNA 100-1000ng
poly(A)+ RNA 50-500ng
Primer
oligo(dT) 5pmoles
random 25pmoles
gene specific 5pmoles
5×Buffer 4μl
10mM dNTPs 2μl(1mM)
ReverTra Ace®(100U/μl) 1μl(100U)
RNase Inhibitor 1μl
Total Volume 20μl
30℃, 10min*
42℃, 20-60min.
99℃, 5min.
*该步骤只在使用Random Primer时需要。
<1st strand DNA合成>
灭菌蒸馏水Xμl
poly(A)+ RNA 0.4μg
oligo(dT) 25pmoles
5×Buffer 4μl
10mM dNTPs 2μl(1mM)
ReverTra Ace®(100U/μl) 1μl(100U)
RNase Inhibitor 20U
Total Volume 20μl
42℃, 30min.
99℃, 5min.
- 几点建议
●反应温度
本酶通常在42℃下进行反应。为了缓和RNA的高级结构而提高反应温度时，须注意引物的退火效率。使用Random引物时，请先在25～30℃下温育10分钟后再开始反应。
●mRNA的热变性
为了缓和RNA的高级结构，先对mRNA进行热变性再进行反应会提高效率。此时请在热变性处理后再添加本酶。
