用途
DNA连接
说明
本试剂是以T4 DNA Ligase为主体的高效率单管型连接试剂，广泛应用于各种末端DNA的连接反应。通过组分条件的优化，使之对冻结/融解的稳定性和反应效率大大提高。是含有连接反应所需要的rATP・DTT等的单管连接试剂。使用时只需按DNA样品溶液的1/2〜同等量加入Ligation high，就可以得到比单独使用T4 DNA Ligase更好的结果。
特征
●简便
只需在DNA样品中混入Ligation high，便可进行高效率的连接反应。
●高效率
与单独使用T4 DNA Ligase相比，可获得50倍以上的效率。
●高稳定性
经实验确认，即使反复冻融50次，也不会降低连接反应的效率。
实验例
1.反复冻融时的稳定性
冻融后，按推荐说明书进行连接反应。结果表明：即使反复冻融50次，也不会降低连接反应的效率。
2. 盐浓度的影响
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本实验探讨DNA溶液中所含的盐（NaCl）浓度对连接效率的影响。 |
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3.反应时间对PCR产物TA克隆的影响
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使用本试剂，将PCR产物插入到T载体中，观察反应时间对实验的影响。实验方法如下：先以λDNA 500bp为目的片段，用rTaq DNA Polymerase进行。将该反应液1μl (约6.4ng)和2μl的T载体(50ng)添加到3μl的Ligation high中，在16℃条件下进行不同时间的温育，再进行连接反应。然后再用各反应液2μl进行大肠杆菌转化，测定白斑和蓝斑的数量。 结果显示，反应时间越长，效率越高，16小时效果最好。2小时以上，蓝斑的数量没有明显变化，而时间越长白斑的数量越多。因此，用Ligation high进行PCR产物的TA克隆时，如想要获得高插入率，建议反应时间在2小时以上，最好是16小时。 |
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※想在短时间内进行TA克隆时，推荐使用Ligation high Ver.2。
4. 反应时间的探讨
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用λ/HindⅢ酶切，用Ligation high在16℃条件下进行不同长度时间的连接反应，EtOH沉淀后进行电泳。 结果可见，HindIII酶切末端，约5min.即可完成充分的连接反应。 |
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参考文献
1)R. L. Hawkins et al., Current Microbiol., 38: 335-341(1999)
使用本产品的文章
1)H. Kamiya et al., Nucleic Acids Research, 28(7): 1640-1646. (2000)
2)H. Kamiya et al., Biol.Pharm.Bull.,27(5): 621-623(2004)
3)Tatsuya Suzuki et al., AnalyticalSciences, 23(1): 65-70 (2007) 3)P. Blackburn, et al., J. Biol. Chem., 252: 5904-5910(1977)
4)P. Blackburn and B. Jailkhani, J. Biol. Chem., 254: 12488-12493(1979)
- 产品内容
Ligation high 375μl ×2支
※1次使用15μl时，可使用50次。
- 注意事项
本试剂中有时会出现沉淀，这是由于作为稳定剂用的BSA形成的，对连接效率没有影响。请勿加温使其溶解，直接使用即可。同时，无须混合使沉淀均质状态，直接将不含沉淀的部分用于反应即可。
- 基本反应条件
载体+插入DNA 15μl
Ligation high 7.5～15μl
↓
16℃、30-60min.
↓
向100μl的Competent cell中加入大约10μl的反应溶液，进行转化。
※在用电穿孔法进行转化时，请将反应液进行脱盐或乙醇沉淀法对DNA进行纯化。
- 几点建议
●TA克隆时
T载体与PCR产物的连接反应，推荐在16℃反应16小时以上。
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