大肠杆菌来源的DNA合成酶
Klenow Fragment (DNA Polymerase I, Large Fragment) Klenow Fragment(DNA PolymeraseⅠ ,Large Fragment)
用途
●双链DNA末端的平滑化
●由引物法导入突变
●用随机引物法进行标记DNA探针的制备
●双脱氧法测序
说明
本酶具有Polymerase活性及较弱的3’→5’Exonuclease活性，利用该性能可用于各种用途。因去除了5’→3’Exonuclease活性，不易受ddNTP的抑制，所以可用于双脱氧法测序反应。
原理
参考文献
1)C. C. Richardson et al., J. Biol. Chem., 239: 222(1964)
2)H. Klenow et al., J. Biochem.,22: 371(1971)
3)H. Klenow et. al., J. Biochem.,45: 623(1974)
4)F. Sanger et al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 74: 5463(1977)
5)J.Sambrook et al., Molecular Cloning(A Laborartory Manual),108, Cold Spring Harbor Laboratory
- 产品内容
Klenow Fragment (1-10U/μl)
组成:
50mM KPO4 (pH7.0)
0.25mM DTT
50% Glycerol
活性的定义:
以poly(dA) : (dT)合成的co-primer为模板/引物，在37℃、PH值7.4下，在30分钟内将10nmoles的全核苷酸摄入为酸不溶性成分所需的酶量为1U。
来源:
E.coli 重组体
纯度:
10U的本酶和1μg的超螺旋φx174 DNA在37℃下反应4小时，DNA的电泳模式未见变化。
- 注意事项
稀释本酶虽然不会引起活性下降，但是搅拌有可能使酶活变弱。因此，请尽量避免进行剧烈的Vortex搅拌。
- 备注
10×Buffer建议由以下组成成分进行制备。
500mM Tris-HCl (pH7.5)
100mM MgCl2
1mM DTT
500μg/ml BSA
- 几点建议
●Nick Translation法
本酶无5'→3'Exonuclease活性,与DNA PolymeraseⅠ不同,不能用于Nick Translation法。
●双链DNA末端的平滑化
用本酶进行双链DNA末端的平滑化时，即使利用3'→5'Exonuclease 活性进行平滑化，也应与利用5'→3'Polymerase活性进行平滑化(fill- in)一样，在反应液中加入dNTPs(终浓度50～100μM)。
但是，由于本酶的3'→5'Exonuclease活性较弱，要想消除突出部分进行平滑化，建议使用Blunting high或T4 DNA Polymerase。
