最适合于RNA病毒等的迅速、高灵敏度定量！
高效率One-step qRT-PCR Kit THUNDERBIRD® Probe One-Step qRT-PCR Kit
用途
Realtime RT-PCR
说明
| 本试剂盒是通过以高效率逆转录酶ReverTra Ace为逆转录酶和以Tth DNA Polymerase为PCR酶的两酶体系，进行一步法荧光定量PCR的试剂盒。主要使用TaqMan分析法进行荧光定量PCR。因为逆转录反应与PCR在同一反应体系中连续进行，反应液的分装操作一次就可以结束，适用于高通量分析。另外，样品间交叉污染的危险性也降低了。本产品中，两种酶与最优化过的buffer组分相组合，可以对微量RNA进行迅速定量。对RNA病毒及表达量低的mRNA的定量有利。另外，不易受目的基因序列的影响，可高灵敏度地检测出各种各样的RNA。 |
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特征
● 迅速・高灵敏度
通过使用Probe的One-step qRT-PCR，可迅速且高灵敏度地对微量RNA进行定量。
● 序列偏差的降低
不易受目的基因序列的影响，可高灵敏度地检测出各种各样的RNA。
将多重检测（Multiplex）时各目的基因扩增的偏差降至最低。
●混杂物抗性的提高
可避免因血红素等的PCR抑制剂导致的灵敏度下降。
●使用dUTP
通过添加Uracil-N-Glycosylase(UNG)*，能够防止因Carryover污染而导致的假阳性发生。
* 本产品中不含有UNG。
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原来的一步法的缺点 |
本试剂盒的改良点 |
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●引物的优化比较困难 【高灵敏度比较困难】 ●容易产生因序列而导致的测定灵敏度偏差 |
●将因引物、探针或目的片段序列而引起的扩增偏差性影响抑制到了最小限度 →有利于各种各样的病毒及mRNA的迅速、高灵敏度检测或定量 |
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●容易因RNA中的混杂物而引起灵敏度下降 |
●能够避免因混杂物引起的抑制 |
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●用TaqMan probe法难于进行多荧光分析 |
●将多重检测中各目的片段扩增的偏差抑制到了最低限度 →最适于以管家基因作为对照的多数基因的相对定量等 |
实验例
1. 肠道病毒RNA的高灵敏度检测
将肠道病毒RNA作4倍稀释，使用TaqMan probe法，与其他公司的产品比较检测灵敏度及定量性。引物、TaqMan probe是直接使用论文记载的序列（没有进行优化处理）。用Applied Biosystems®、StepOnePlus™进行分析。
2. 各种病毒检测灵敏度的比较
制备11种病毒RNA的4倍稀释系列溶液，使用TaqMan probe法，进行最高检测灵敏度的比较。引物、TaqMan probe是直接使用论文记载的序列。用Applied Biosystems®、StepOnePlus™进行分析。
将各试剂能检测到的最低拷贝数连线作图。
结果显示：只有用本试剂盒时，才能对所有的目的基因以30个拷贝以下的灵敏度进行检测及定量。通过这个实验表明，本试剂不受目的片段序列的影响，能以高灵敏度检测到各种各样的RNA。
3. 多重荧光检测（Multiplex）体系中的表达定量
使用三种荧光标记的TaqMan探针，分别用单独检测及一次使用三种TaqMan探针的多重荧光检测体系，分析IL-1β、TNF-α、GAPDH基因的表达量。
实验中以HeLa S3 RNA（1pg~100ng的10倍稀释【6个梯度】）为样品，用Roche Diagnositics公司的LightCycler 96进行分析。
结果显示，各基因用单独（图1）及使用三通道的多重荧光检测（图2）分析中得到了相同的灵敏度，PCR效率及相关系数并没有太大的差异（表1）。
4. 使用临床检测样本的RS病毒A型、B型的同时定量
使用从20个检测体的咽喉粘液中提取的RNA样品，用RT-PCR法及使用THUNDERBIRD One-step qRT-PCR试剂盒的qRT-PCR，进行RS病毒的检测。
另外，同时与用抗体检测方法进行分析的结果进行比较。
为了判断RS病毒的A型和B型，使用特异的引物及各种不同荧光标记的TaqMan探针，用qRT-PCR进行定量分析。
用Roche Diagnositics公司的LightCycler 96进行分析。结果显示，抗体检测法中判定为假阴性的检测体，用PCR法可以高相关性地判定有无感染。另外，类型判定结果也完全一致。
使用各种不同的方法对RS病毒的检测相关试验结果
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检测体编号 |
抗体检测方法 |
PCR（定性、类型判定） |
qPCR分析的定量值（拷贝数） |
|
|
A型检测（FAM, 470nm） |
B型检测 （Cy5, 645nm） |
|||
|
1 |
+ |
+（A） |
1.6×105 |
- |
|
2 |
- |
- |
- |
- |
|
3 |
+ |
+（A） |
8.1×104 |
- |
|
4 |
+ |
+（A） |
2.7×105 |
- |
|
5 |
- |
+（A） |
9.6×102 |
- |
|
6 |
- |
+（A） |
3.6×103 |
- |
|
7 |
+ |
+（A） |
2.3×106 |
- |
|
8 |
- |
- |
- |
- |
|
9 |
+ |
+（A） |
1.5×105 |
- |
|
10 |
+ |
+（A） |
6.7×105 |
- |
|
11 |
- |
- |
- |
- |
|
12 |
+ |
+（A） |
1.6×105 |
- |
|
13 |
+ |
+（A） |
9.4×103 |
- |
|
14 |
- |
+（A） |
9.5×103 |
- |
|
15 |
+ |
+（A） |
3.9×105 |
- |
|
16 |
+ |
+（A） |
2.4×105 |
- |
|
17 |
- |
- |
- |
- |
|
18 |
- |
+（A） |
4.2×104 |
- |
|
19 |
- |
+（A） |
3.4×102 |
- |
|
20 |
- |
+（A） |
- |
9.6×103 |
参考文献
- 产品内容
【QRZ-101】
2× Reaction Buffer1.25ml ×2支
DNA Polymerase125μl
RT Enzyme Mix125μl
50× ROX reference dye100μl
2× Reaction Buffer1.25ml ×2支
(50μl体系100次，或20μl体系250次)
【QRZ-101S】
2× Reaction Buffer500μl
DNA Polymerase25μl
RT Enzyme Mix25μl
50× ROX reference dye*20μl
2× Reaction Buffer500μl
(50μl体系20次，或20μl体系50次)
*ROX溶液是另外添加的，可以对应几乎所有的荧光定量PCR检测仪器。
- 基本反应条件
RNase free waterXμl
2×Reaction Buffer25μl
DNA Polymerase1.25μl
RT Enzyme Mix1.25μl
Forward Primer25pmol
Reverse Primer25pmol
TaqMan® probe10pmol
RNA溶液Yμl
50× ROX Reference dye*11/0.1μl
(Uracil-N-Glycosylase1unit*2)
Total Volume50μl
*1 50×ROX reference dye，是对于使用 Passive Reference 的仪器（如Applied Biosystems 公司制造的仪器等），为校正各孔间的荧光强度及分注误差而使用。不用 Passive Reference 进行校正的仪器无需添加。
*2 使用Uracil-N-Glycosylase(UNG)处理时，请使用热敏性(heat-labile)UNG。可根据各公司推荐的条件，调整酶的用量。
Cycle
(20～25℃ 10min.*3)
↓
50℃ 10min.
↓
95℃ 1min.
↓
95℃ 15sec.
60℃ 45sec. 40～45 cycles
*3 进行UNG处理时，请在逆转录反应前，设定UNG反应步骤。上述表示的是一般温度条件及反应时间，请根据各公司的推荐条件进行调整。
- 几点建议
防止因携带污染（carryover）而产生的假阳性
- 备注
本产品是得到Chakrabarti Advanced Technology NewCo LLC.公司US7772383专利的授权进行销售的。
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