单酶・one-step法迅速・高性能Realtime PCR试剂
one-step qRT-PCR Kit RNA-direct™ Realtime PCR Master Mix 系列
价格表
RNA-direct™ Realtime PCR Master Mix
| Code No. | 包装 | 价格 | 保存温度 | 说明书 |
|---|---|---|---|---|
| QRT-101 | 500μl×5支(100次份) | RMB 2,000 | -20℃ |
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RNA-direct™ SYBR® Green Realtime PCR Master Mix
| Code No. | 包装 | 价格 | 保存温度 | 说明书 |
|---|---|---|---|---|
| QRT-201 | 500μl×5支(100次份) | RMB 2,000 | -20℃ |
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用途
Realtime RT-PCR
说明
Tth DNA polymerase是在Mn2+存在下，具有很强的逆转录活性的独特的酶，在单一反应体系内可进行cDNA的合成及PCR的连续反应。利用该特性，开发出单酶一步法定量PCR试剂盒，与在同一反应中使用RTase及Taq DNA polymerase的「两酶一步法」体系试剂相比，使用单酶时，最适反应条件的设定较容易，而且能够得到更高的分析效率。
特征
●一步法高通量分析
本品以 RNA 为模板，能够在同一反应体系内进行定量PCR分析，非常适合于需要快速分析的多重检测体系。
●特异性高
本品采用抗体法热启动，对控制非特异性扩增非常有效。
●适用性广
探针法及SYBR® Green I 法都可以适用。
●可用于不同类型的仪器
因为含有参比染料（Passive reference），可适用于需要校正的检测仪器(如Applied Biosystems® StepOnePlusTM 等)。
●可用于易于形成高级结构的 RNA 和高 GC 含量的模板
可用于使用玻璃毛细管型的检测仪器(如Roche Diagnostics公司的LightCycler® )。
逆转录反应在高温下进行，所以也适用于易于形成高级结构的模板RNA。而且，众所周知，Tth DNA polymerase对GC含量高的序列的扩增效率非常高，可有效检测GC含量高的目的片段。
实验例
1. 与『两步法体系(RTase + Taq)』相关性的比较
通过以各种人组织来源的RNA为样品，对蛋白酶δ（PKCδ）的表达进行分析，比较了与使用一般的两步法的荧光定量PCR分析法的相关性。
黄色柱状图表示的是使用本产品的定量结果，左边是使用50ng、右边是使用200ng的Total RNA得到的结果。蓝色柱状图表示的是使用本公司高效率逆转录试剂盒「ReverTra Ace -α-®」[FSK-101]与Taq酶为基础的荧光定量PCR试剂「SYBR® Green Realtime PCR Master Mix -Plus-」[QPK-212]组合的两步法体系检测的结果。
结果显示，使用一步法的本产品与两步法体系得到了相同的结果。
2. TaqMan® 探针法分析的性能比较
RNA-directTM 与两酶一步法(仪器:使用BioFlux公司的 Line Gene)
以mRNA为模板，与使用Taq+RTase混合型的A公司的试剂(两酶一步法体系)进行了比较实验。
以人培养细胞提取的mRNA（10n倍稀释系列(n=2)）为模板，用TaqMan® 探针法对β-actin的mRNA进行检测（作100倍稀释，使用20μl反应液中含有5ng的Poly(A)+ RNA）。结果显示，使用RNA-directTM Realtime PCR Master Mix的反应中，即使使用A公司试剂推荐的反应条件，也会得到起峰早及直线性的良好结果。
3. SYBR® Green分析法中直线性的讨论
RNA-directTM 与两酶一步法（仪器:使用ABI公司的PRISM® 7900HT）
以HeLa细胞来源的Total RNA（10n倍稀释系列(n=2)）为模板,用SYBR® Green分析法检测β-actin的mRNA（作100倍稀释，使用20μl反应液中含有75ng的Total RNA）。
结果显示，与Taq+RTase混合型的B公司试剂盒相比，RNA-directTM SYBR® Green Realtime PCR Master Mix的反应中，至少可以在7个梯度的稀释系列中表示出高度相关性。
4. SYBR® Green分析法中性能的比较
RNA-directTM 与一酶一步法(仪器:使用Roche公司的 LightCyclerTM)
以人培养细胞提取的Poly(A)+RNA（10n倍稀释系列(n=2)）为模板，用SYBR® Green分析法检测G3PDH 的mRNA (作100倍稀释，使用20μl反应液中含有5ng的Poly(A)+ RNA)。
结果显示，与同样使用Tth DNA Polymerase的C公司试剂相比，RNA-directTM SYBR® Green Realtime PCR Master Mix的检测中，起峰早、信号强以及检测灵敏度都得到了极大提高。
参考文献
T. W. Myers and D. H. Gelfand, Biochem., 30: 7661-7666(1991)
- 产品内容
〈QRT-101, QRT-201〉
Master Mix0.5ml ×5支
50mM Mn(OAc)20.5ml ×1支
(50μl反应体系可使用100次，20μl反应体系可使用250次)
保存 -20℃(避光保存)
- 基本反应条件
〈SYBR® Green I 法〉
使用ABI PRISM®7900HT(Applied Bio.)
灭菌水X μl
Master Mix25μl
50mM Mn(OAc)22.5μl
各Primer10pmoles each
RNA样品<1μg
Total Volume50μl
Cycle
90℃ 30sec.
61℃ 20min.
↓
95℃ 60sec.
↓
95℃ 15sec.
*55～65℃ 15sec. 45cycles
74℃ 45sec.
※退火温度，请根据引物的Tm在55～65℃范围内进行调整。
- 备注
LightCycler® 是Idaho Technology Inc.的商标。
SYBR® 是Molecular Probes Inc.注册的商标。
TaqMan® 是Roche Molecular Systems Inc.注册的商标。
ABI PRISM® 是Applied Biosystems® Inc.注册的商标。
- 几点建议
●保存
长期保存时，推荐在-20 ℃ 避光保存。但是，如果在短期内需持续使用时，可于4 ℃ 避光保存3周左右。
●逆转录反应时的引物PCR的Reverse Primer可以直接当作逆转录引物使用。
无需另外添加。另外，不能使用Oligo dT或Random Primer。
●样品的添加量
用10μl等少量反应体系进行反应时，样品不要以1μl这样极少量的水平添加，可通过稀释后添加2μl左右的量，这样可以抑制移液器误差，得到良好的结果。
●关于参比染料（passive reference）
可预先混合。可以在培养板型PCR仪器上直接使用。
另外，对不使用参比染料（passive reference）的PCR仪器也没有影响。
●关于锰离子溶液
RNA-directTM Realtime PCR系列中，另外单独添加了一管足够量的醋酸锰溶液 (橙色标签)。
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相关产品
●RNA制备相关的试剂及用具
| 品名 | Code No. | 包装 | 价格 | 保存温度 | 说明书下载 |
|---|---|---|---|---|---|
| MagExtractorTM –Viral RNA- | NPK-401F | 100次份 | RMB 1,600 | 4℃ |
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| MagExtractorTM –RNA- | NPK-201F | 100次份 | RMB 2,600 | 4℃ |
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| Magical Trapper | MGS-101 | 1个 | RMB 1,000 | 室温 | - |
