一步法RT-PCR试剂盒。与原来产品相比，检测灵敏度提高了大约100倍。
One-step RT-PCR 试剂盒 RT-PCR Quick Master Mix
用途
●RT-PCR
说明
本产品是使用rTth DNA Polymerase 的单酶・一步法RT-PCR试剂盒。
采用了热启动法，可进行高灵敏度的检测。
在Mn2+存在的条件下，Tth DNA polymerase是具有逆转率活性的独特的酶，使用该酶，可在同一管内连续进行cDNA的合成反应及PCR。
本试剂是深受好评的一步法RT-PCR试剂盒「RT-PCR high -Plus- <<逆转录一次成功>>」的升级版，性能得到了极大提高，更加适用于各种用途。
实验例
1. 与本公司原来产品灵敏度的比较
使用阳性对照RNA*与引物对，以约450bp人的G3PDH mRNA的区域为目的片段进行RT-PCR。
结果显示，RT-PCR Quick Master Mix与本公司原来的产品相比，灵敏度提高了100倍。
B: 空白对照
【样品】人的G3PDH mRNA* (106 ~ 102拷贝/50μl反应体系)
*通过in vivo transcription法配制。
【引物】
Primer(F): 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3' (20mer)
Primer(R): 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3' (20mer)
【循环条件】
90℃ 0:30 →60℃ 30:00 →94℃ 1:00
→ (94℃ 0:30 → 60℃ 0:30 → 72℃ 1:00) x 40循环→72℃ 1:00
2. 使用mRNA进行cdc2基因的检测
以人培养细胞来源的mRNA(5ng、0.5ng)为模板，以人的cdc2的ORF全长(约900bp)为目的片段进行RT-PCR。
cdc2基因编码细胞周期相关的蛋白质。
结果显示，用本公司原来的产品不能检测的目的片段，用RT-PCR Quick Master Mix进行反应时，得到了良好的扩增结果。
【引物】
Cdc2-F : 5'-CCATACCATTGACTAACTATGGAAGAT-3' (27mer)
Cdc2-R : 5'-GTCAGAAAGCTACATCTTCTTAATCTG -3' (27mer)
【循环条件】
90℃ 0:30 →60℃ 30:00 →94℃ 1:00
→(94℃ 0:30 → 60℃ 0:30 → 72℃ 1:00) x 40循环→72℃ 1:00
参考文献
1)T. M. Myers and D. H. Gelfand, Biochem., 30: 7661-7666(1991)
- 产品内容
2×RT-PCR Quick Master Mix 625μl×2
50mM Mn(OAc)2 200μl
Nuclease-free Water 1100μl
- 基本反应条件
灭菌蒸馏水 Xμl
2×Master Mix 25μl
50mM Mn(0Ac)2 2.5μl
各Primer 10pmoles each
RNA样品
Total RNA <2.5μg
Poly(A)+ RNA < 500 n g
Total Volume 50μl
Cycle
90℃, 30sec.
60℃, 30min.
↓
94℃, 1min.
↓
94℃, 30sec.
50～70℃ 30sec. 30～40Cycles
72℃, 1min.
↓
72℃, 7min.
※考虑退火温度、引物的Tm值，可在50～70℃之间进行调整。
- 几点建议
●引物的设计
RT-PCR用引物设计方法 在这里 进行介绍。
●逆转录反应时的引物
PCR用的Reverse Primer直接当作逆转录用的引物。
无需另外添加。另外，不能使用Oligo dT或Random Primer。
●RT-PCR产物的克隆
本试剂盒在Mn2+存在时可进行PCR，与使用Mg2+的通常的PCR相比，保真性进一步降低了。因此，本产品适合于克隆用PCR。
