可用于DNA/RNA片段的脱磷酸化。防止发生自连反应。
大肠杆菌来源的脱磷酸化酶 E.coli Alkaline Phosphatase
用途
●防止克隆载体的自身连接反应
●由Kinase利用[γ-32 P]ATP对DNA/RNA进行5'末端标记的前处理
说明
本酶分子量为80,000～90,000，等电点(PI)=4.5，最适pH值为8.0，具有分解DNA及RNA的单磷酸酯键的活性。
不对双磷酸酯键或三磷酸酯键起作用，但对ATP等的焦磷酸结合显示出水解活性。抑制剂有螯合剂和无机磷酸。
连接反应中DNA片段的5'末端必须有磷酸根，利用这一点，使用本酶对内切酶处理后的载体进行脱磷酸化处理，可防止自连反应。
另外，制作5'末端标记探针时，预先除去探针的5’端磷酸根，可提高由Kinase利用[γ-32P]ATP添加标记磷酸根的效率。
特征
●高耐热性
本酶显示出较高的耐热性，适用于平滑末端DNA片段等的高温长时间处理。
原理
参考文献
1)T. W. Reid and I. B. Willson, The Enzymes(3rd Ed.), 4: 373
2)A. Gaven and C. Levinthal, Biochem. Biophys. Acta., 38:470(1960)
3)K. Yoda et al., Agric. Biol.Chem., 44: 1213(1980)
- 产品内容
E.coli Alkaline Phosphatase
(0.1-1U/μl)
10×Buffer[BAP-1R]
组分:
50mM Tris-HCl (pH7.5)
50% Glycerol
10×Buffer [Code No. BAP-1R]
组成:
500mM Tris-HCl (pH8.0)
10mM MgCl2
活性的定义:
25℃时1分钟内1M Tris-HCl(pH8.0)中水解1μmole的p-Nitorophenyl phosphate所需的酶量称为1U。
来源:
E.coli K12 SW1033/pk 1-5
纯度:
2U的本酶与1μg的λ DNA/Hind Ⅲ分解物在37℃反应16小时，DNA电泳模式未发生变化。
2U的本酶与2μg的tRNA在37℃下反应16小时，tRNA的电泳模式未发生变化。
- 基本反应条件
灭菌蒸馏水Xμl
DNA 0.5～2.5μg
10×Buffer 10μl
Alkaline Phosphatase 10μl
Total Volume 100μl
↓
37℃、60min.(5'突出末端)
60℃、60min.(3'突出、平滑末端)
- 几点建议
●反应后样品的纯化
本酶耐热性高，加热处理不会失活。本酶带入连接反应中后，效率会大幅度降低，所以反应后的样品必需用苯酚处理，或用试剂盒进行纯化。纯化试剂盒推荐用MagExtractorTM -PCR & Gel Clean up- 等。
●与Calf intestine Alkaline phosphatase 性质的比较
请参考Calf intestine Alkaline phosphatase 的实验例。
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脱磷酸化反应后的样品制备
| 品名 | Code No. | 包装 | 价格 | 保存温度 | 说明书下载 |
|---|---|---|---|---|---|
| MagExtractorTM –PCR & Gel Clean up- | NPK-601 | 200次份 | RMB 1,200 | 室温 |
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