通过强3'→5'Exonuclease活性进行DNA的平滑化及3'末端标记。
大肠杆菌来源的DNA合成酶 T4 DNA Polymerase
用途
●双链DNA末端的平滑化
●用引物延伸法进行mRNA转录起始点的分析
●DNA片段3'末端的标记
说明
dNTPs存在条件下，使用本酶对具有3’末端突出的双链DNA进行作用时，达到平滑状态时，Exonuclease活性与Polymerase活性呈竞争状态。另一方面，dNTPs不存在时，会进行Exonuclease活性引起的DNA分解反应。
原理
参考文献
1)A. Panet et al., Biochemistry, 12: 5045-5050(1973)
2)M. Goulian et al., J. Biol. Chem., 243: 627-638(1968)
3)I. R. Lehman, Methods in Enzymology, 29: 46-53(1974)
4)F. Sanger and A. R. Coulson, J. Mol. Biol., 94: 441(1975)
5)J. Sambrook et al., Molecular Cloning(A LaborartoryManual),108, Cold Spring Harbor Laboratory
6)R. M. Warlet and W. S.Reznikoff, Gene, 9: 307-319(1980)
7)N. Davidson et al., Gene, 42: 21-29(1986)
- 产品内容
T4 DNA Polymerase
10×Buffer
组成:
200mM KPO4 (pH7.0)
2mM DTT
50% Glycerol
10×Buffer组成:
500mM Tris-HCl (pH8.5)
70mM MgCl2
150mM (NH4 )2 SO4
5mM DTT
1mM EDTA
活性的定义:
以用Mung Bean Nuclease部分消化的热变性的小牛胸腺DNA为模板/引物，在37℃下，在30分钟内将10nmoles的全核苷酸摄入为酸不溶性成分所需的酶量为1U。
来源:
E.coli B infected with T4 phage
纯度:
10U的本酶和1μg的超螺旋φx174 DNA在37℃下反应5小时，DNA的电泳模式未见变化。
- 基本反应条件
<5'末端的平滑化>
底物DNA 0.5～2μg
10×Buffer 2.5μl
2mM dNTPs 0.5μl
T4 DNA Polymerase 2U
Total Volume 25μl
37℃, 2hr.
底物DNA 0.2～0.5μg
10×Buffer 2μl
T4 DNA Polymerase 1U
Total Volume 20μl
37℃、Xmin.
反应时间，根据要去除的长度设定。按30～80base/min.的标准设定。
↓
add: 含标签的2mM dNTPs 1μl
37℃, 1hr.
- 注意事项
●DNA合成反应
本酶因易受DNA高级结构的影响，推荐在通常的DNA延伸反应中使用Klenow Fragment。
●双链DNA末端的平滑化
用本酶进行双链DNA末端的平滑化时，即使利用3'→5'Exonuclease 活性进行平滑化，也请在反应液中加入dNTPs(终浓度40～100μM)。
●最适pH
本酶的最适pH为8～9，pH7.5及pH9.7时活性约为前者的1/2。大量使用pH8～9范围以外的缓冲液中溶解的DNA样品时，推荐用乙醇沉淀或纯化试剂盒(请参考相关产品)等进行缓冲液的替换。
