实验例19：使用KOD FX对黄色黑腹果蝇羽翼的简便Long PCR法

　※Triton X-100 (+) : 表示反应体系中含终浓度为0.002%(v/v)的Triton X-100。

【背景】
以前，通过PCR方法对黄色黑腹果蝇进行基因分型，必须用整一个黄色黑腹果蝇抽提DNA以获得足量的模板。而用本方法，则可在黄色黑腹果蝇不被致死的状态下简便地进行突变筛查等，判定后还可继续繁殖，或用于其他试验。可大大提高实验效率，节省实验材料。

【样品】
黄色黑腹果蝇羽翼

【前处理】
把黄色黑腹果蝇麻醉后，从根部将其羽翼切断，浮在离心管的碱溶液上面。溶液按HotSHOT法（Truett等，2000年）配制，但最后要加等量酸性溶液中和。

【目的片段】
黑腹果蝇Rh5基因 2.1kb，5kb

【引物】
2.1 kb (2,135bp)
Primer F1, 5’-GGATTTTCGAGTTGCCATGT-3’
Primer R1, 5’-GTCCGTGTTGGTCAGGTAAT-3’

5kb (4,952bp)
Primer F1; Primer R2, 5’-GCAAGTGCGAAATGGGTGTA-3’

3.2kb (3,254bp)
Primer F1; Primer R3, 5’-CGTATTCGGATTGGTTGGAT-3’

【反应液组成】

灭菌蒸馏水	X <μl>
2x PCR Buffer for KOD FX	25
2mM dNTPs	10 （0.4mM）
10 pmol/μl Primer  F	2.5
10 pmol/μl Primer  R	2.5
KOD FX (1U/μl)	1
0.1%(V/V) Triton X-100	1~5 (final 0.01~0.002%)*
黑腹果蝇羽翼Lysate	5
Total	50 μl

*按终浓度0.01～0.002%添加Triton X-100，可提高扩增效率。但根据引物的不同，也会出现非特异性条带增加的情况。

※Taq DNA polymerase按其推荐反应条件进行PCR。

【PCR 循环】

[KOD FX]

94˚C (2 min)
↓
98˚C (10 s) and 68˚C (5 min)  ×　35 cycles

[Taq]

95˚C (2 min)
↓
95˚C (30 s), 57˚C (45 s) and 72˚C (5 min) 　×　40 cycles

【结果】（参照上图）

使用KOD FX，可对黑腹果蝇羽翼Lysate（至5kb）确认到扩增。虽然用KOD FX对未经处理的羽翼直接PCR也可以确认到扩增，但用HotSHOT法配制的Lysate进行PCR效率更高且结果更稳定。
用黑腹果蝇的平衡器或头部Lysate也可得到同样的结果。而用羽翼的末端一半则不能得到扩增。配制全身Lysate时，要用tip头或beads将果蝇的外骨骼破坏。相比羽翼，对全身进行扩增容易产生非特异性条带，因此，建议增加Lysate的液量或将其稀释。

验证添加TritonX-100效果的实验（辅助资料）   用羽翼Lysate对Rh5基因的野生型（3.2kb）与缺失突变体（1.7kb）的Genotyping进行扩增（Hanai&Ishida 2009年）。这里使用的引物对效率很低，不添加Tx100，进行三步法循环，几乎无法确认到3kb的扩增（a）。往PCR反应液里添加Triton X-100至终浓度0.01%，可得到良好的结果（b）。

【数据提供】
独立行政法人 产业技术综合研究所
生物机能工学研究部门 生物钟研究团队
花井修次 老师

【来自老师的评语】
本试验使用KOD FX，有如下好处： 

1． 用转座子进行基因突变时，因KOD FX可扩增长度很长的片段，因而效果特别好。 

2． DNA抽提简便，可在不致死果蝇的情况下进行筛查，非常节省人力，对后续试验的开展也很有利。

【参考文献】
Truett, GE, Heeger P, Mynatt, RL et al (2000) Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT). Biotechniques 29: 52, 54.
Hanai, S and Ishida, N (2009) Entrainment of Drosophila circadian clock to green and yellow light by Rh1, Rh5, Rh6 and CRY. Neuroreport. 20:755-8.