Fig. 1　PCR产物的电泳结果
在各泳道各注入2.5μl的PCR産物。图中的①~⑥表示PCR条件(Table 1) ，①,② 为使用A公司高效率Taq进行的普通PCR，③,④为以①的PCR产物为模板的nested PCR，⑤为使用KOD FX的PCR，⑥表示用A公司高效率Taq可确认到扩增结果的样品的DNA抽提液进行的阳性对照。

Table 1    PCR条件
按5组条件进行PCR，各条件的PCR产物标为①~⑥。⑥为用A公司高效率Taq可确认到扩增结果的样品的DNA抽提液进行的阳性对照。

= = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = =
【背景】

　 目前，本实验室正在进行汽水湖（淡水与海水交接处的水域）中刚毛藻属藻类（绿藻）的多样性研究。作为其中的一部分，需要进行天然藻体的直接测序。此时，用PCR进行DNA扩增不可或缺。我们知道，作为样品的刚毛藻属藻类含有很多多糖类成分，这在PCR时会抑制DNA聚合酶的酶反应。因此，至今为止，在抽提模板DNA时，多采用能较好除去多糖以及蛋白质的CTAB法，PCR步骤用A公司高效率Taq对DNA进行扩增。然而，虽然从高盐浓度区域采集的样品可顺利确认到扩增，但从低盐浓度及淡水区域采集到的样品用该方法却几乎无法确认到扩增。为此，采用了CTAB法以外的DNA抽提、苯酚/氯仿等方法对DNA进行纯化，反复确认与nestedPCR及引物的序列、组合相关的可能错误，但仍没能改善结果。因此，本实验采用了高保真性、高效率的KOD FX，对淡水域的刚毛藻属藻类的DNA片段进行扩增，并探讨前述实验中未能确认到扩增的原因。 

【样品】淡水产刚毛藻属藻类

【样品的处理】抽提：CTAB法

【基因名】rRNA基因的ITS区域

【片段长】约700~1200bp

【反应液组成】

【PCR循环】

・A公司高效率Taq
 　　　 94℃,2 min  
　　　　 ↓
                     [ 94℃, 30 sec   63 or 66℃, 30 sec   72℃,1 min ]   30 cycle
　　　　 ↓
  　　 72℃,5 min 

・ KOD FX
        94℃,2min  
        　 ↓
        [ 98℃,10 sec   65℃, 30 sec   68℃, 2 min ]   30 cycle

【引物的位点设定】

Fig. 2　引物的位点信息
这里展示一下PCR时引物的位点信息。第一次PCR时使用了A,B的引物对，nested PCR时使用C,D的引物对。Primer A: 29 mer, Primer B: 23 mer, Primer C: 22 mer, Primer D: 20 mer。

【结果】

　 对应于本次的4个样品，用A公司高效率Taq・引物A,B的PCR（退火温度63,66℃）、退火温度63℃条件下得到的PCR产物为模板，A公司高效率Taq・引物C,D的nested PCR（退火温度63,66℃）以及KOD FX・引物C,D的PCR，共20个（4个样品×5组条件）实验。（Table.1）
结果可见，用A公司高效率Taq进行普通的PCR几乎无法观察到扩增（Fig. 1　①,②）、nested PCR时整体出现弥散，而无法确认到目的片段的扩增（Fig. 1  ③,④）。而使用KOD FX的PCR则可确认到目的片段的扩增（Fig. 1　⑤）。

【探讨】

　 由本实验可见，KOD FX对过去无法扩增的淡水刚毛藻类（绿藻）的DNA有效果。从测序的结果可见，过去在低盐浓度・淡水域采集的个体中含两种刚毛藻，其中淡水产标记的一种个体PCR没有确认到扩增。而海产的种类虽然可顺利进行PCR确认到扩增，但主要是由于淡水产类和海产类分布区域不同，体内含有物质的差异，导致了一种能扩增一种不能扩增。使用KOD FX之前，我们认为可能是由于低盐浓度区域特有的污染・引物序列的不一致等问题造成的，从本次实验结果可见，用KOD FX前者可以扩增，而后者被丢弃了。



【数据提供】
福井县立大学 海洋生物资源学部
神谷 充伸 老师