改善循环后半段的扩增停滞现象。通过缩短延伸时间(30 sec/kb)实现理想的克隆PCR。
高保真･高效率･高速PCR酶 KOD -Plus- Neo
用途
PCR
说明
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KOD -Plus- Neo在高保真性PCR酶KOD -Plus-系列技术的基础上，应用了本公司新开发的「延伸增强剂」，保持了KOD -Plus-系列高保真性（约为Taq的80倍）的同时，通过抑制<停滞现象>，明显提高了对微量模板DNA、长目的片段的扩增效率。 |
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特征
●可对微量模板DNA进行高保真・高效率的扩增
通过应用延伸增强剂技术，即便是微量模板DNA也可对目的基因进行高保真・高效率的扩增。同时本酶具备高保真性（约为Taq的80倍），可准确地对低拷贝数模板的目的基因进行扩增。
※PCR错配率是通过使用各种酶以人基因组DNA为模板扩增β-globin基因(2.4kb)，对PCR产物进行TA克隆后，对96个克隆进行测序分析，测得的结果。
●缩短了延伸时间<30sec./kb>（长目的片段更方便）
延伸时间从原产品的60sec./kb缩短到30sec./kb。对长目的片段的扩增更加方便。
●实现了各种引物同一循环条件
20mer以上的引物(Tm值>63℃)可先尝试2步法。循环条件无需探讨非常简便。（请参考基本反应条件）
*Tm值采用最邻近法(Nearest Neighbor method)计算得到的值。
●长目的片段的扩增
提高了延伸性，可对各种长度的目的片段进行扩增。已通过实验确认可对24kb的基因组DNA进行扩增。
●采用热启动法，提高了PCR性能
原理
KOD DNA polymerase具有强有力的3’→5’核酸外切酶活性（校正活性），可准确地对目的片段进行扩增，作为克隆用PCR酶获得了广泛的好评。 然而，高保真性PCR酶在20〜30循环以后，容易出现扩增无法持续的<停滞现象>。
KOD -Plus- Neo在高保真性PCR酶：KOD -Plus-系列技术的基础上，应用了本公司新开发的「延伸增强剂」，保持了KOD -Plus-系列高保真性（约为Taq的80倍）的同时，通过抑制<停滞现象>，明显提高了对微量模板DNA、长目的片段的扩增效率。
实验例
1. Total RNA的各种基因全长ORF的扩增
以HeLa细胞来源的Total RNA逆转录后得到的cDNA（Total RNA 50 ng相当）为模板， 对各种蛋白激酶的ORF（open reading frame）的全长扩增。反应根据各PCR酶的推荐条件进行了30个循环。结果可见，只有用KOD -Plus- Neo的情况下，所有的基因都能得到明亮的扩增产物，所有的ORF都能迅速地进行克隆。
2. β-globin基因上各种长度区域的扩增效率・延伸性的比较
以人基因组DNA（50ng）为模板，对各种长度的β -globin 基因进行扩增。反应按各PCR 酶的推荐条件，进行了30个循环。结果显示，只有用KOD -Plus- Neo 的情况下，17.5 kb 的片段能确认得到明亮的条带。 而且，17.5 kb 以下的片段，用KOD -Plus- Neo 的得率要高得多。
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参考文献
1) M. Takagi et al., Appl. Environ. Microbiol., 63 : 4504-4510 (1997)
2) H. Hashimoto et al., J. Biochem.(Tokyo), 125 : 983-986 (1999)
3) H. Mizuguchi et al., J. Biochem.(Tokyo), 126 : 762-768 (1999)
4) M. Nishioka et al., J. Biotechnol., 88 : 141-149 (2001)
5) H. Hashimoto et al., J. Mol. Biol., 306 : 469-77 (2001)
6) T. Imanaka et al., J. Chin. Inst.Chem. Engrs., 32 : 277-288 (2001)
- 产品内容
【KOD-401】
KOD -Plus- Neo (1U/μl)200μl ×1支
10×PCR Buffer for KOD -Plus- Neo [KOD-4B]1ml ×1支
25mM MgSO4[KOD-2S]1ml ×1支
2mM dNTP [NTP-201]1ml ×1支
※50μl反应体系的情况下可使用200次。
组分:
50mM Tris-HCl (pH8.0)
25mM KCI
0.1mM EDTA
1mM DTT
0.05% Tween®-20
0.05% Nonidet®P-40
50% Glycerol
活性的定义:
在75℃活性测定条件下，在30分钟内摄入10nmoles的全核苷酸使成为酸不溶物时所需酶的活性定义为1U。
来源:
E.coli重组体
- 基本反应条件
灭菌蒸馏水X μl
2mM dNTPs5μl
25mM MgSO43μl
10pmol/μl Primer F1.5μl
10pmol/μl Primer R1.5μl
KOD -Plus- Neo (1.0U/μl)1μl
Genomic DNA～200ng
Plasmid DNA～50ng
cDNA～200ng（RNA相当）
10×PCR Buffer for KOD -Plus- Neo5μlTotal Volume50μl
〈2 Step Cycle〉*
94℃ 2min.
↓
98℃ 10sec.
68℃ 30sec./kb 25～45 cycles
〈3 Step Cycle〉*
94℃ 2min.
↓
98℃ 10sec.
Tm℃ 30sec.
68℃ 30sec./kb 25～45 cycles
〈Step Down Cycle〉*
94℃ 2min.
↓
98℃ 10sec.
74℃ 30sec./kb 5 cycles
↓
98℃ 10sec.
72℃ 30sec./kb 5 cycles
↓
98℃ 10sec.
70℃ 30sec./kb 5 cycles
↓
98℃ 10sec.
68℃ 30sec./kb 15～30 cycles
↓
68℃ 7min.
*引物的Tm值高于63℃的情况下，请用两步法。
引物的Tm值在63℃以下，或用两步法无法确认到扩增时，请尝试用三步法。
此外，当扩增产物出现杂带或弥散时，请尝试Step down方法。
※Tm值采用最邻近法（Nearest Neighbor method）计算得到的值。
引物的Tm值以及扩增产物的Tm值计算请点击此处进入在线工具
- 几点建议
●PCR产物的克隆
由于本酶的PCR产物已被平滑化，可用平滑末端克隆法进行克隆。此时，如已对载体进行了脱磷酸化处理，就需要对PCR产物进行磷酸化，或使用带5'磷酸基的引物。另外，由于本酶的PCR产物已被平滑化，不能直接进行TA克隆。可使用按以下方法开发的TA克隆专用试剂盒「TArget Clone -Plus-」。
●PCR条件的设定
酶的标准使用量为50μl反应体系1U。延伸反应在68℃条件下进行，按1kb目的片段1min.的标准。出现拖尾条带时，可降低MgSO4浓度，无法确认到扩增时，可提高MgSO4浓度。
●高GC含量的模板
在反应液中添加终浓度为2〜5%的DMSO可得到改善。
●以RT反应液为模板的情况
过量带入RT反应液有可能会对PCR反应产生抑制作用。建议带入到PCR的RT反应液在PCR反应液的1/25以下（最好在1/50以下）。这样就无需考虑RT反应液中Mg2+、dNTPs的影响，只要按照基本反应条件添加本酶中添付的dNTPs和MgSO4即可。
●引物的设计
3'端有错配的引物，可能会受本酶校正。FAQ请点击这里
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(单独销售的组分)
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